CBF1基因過量表達(dá)能提高擬南芥植株的抗寒性。苜蓿是飼草料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要草種，低溫等逆境脅迫會導(dǎo)致苜蓿減產(chǎn)?？蒲腥藛T從擬南芥植株中克隆得到冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（At-CBF1）基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗寒紫花苜蓿，以使苜蓿安全越冬和提高產(chǎn)量?；卮鹣铝袉栴}：
（1）在擴(kuò)增At-CBF1基因的過程中，先根據(jù)

At-CBF1基因的核苷酸序列

At-CBF1基因的核苷酸序列

設(shè)計引物，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增時，反應(yīng)體系的初始溫度設(shè)置在90～95℃的目的是

使目的基因 DNA受熱變性后解鏈為單鏈

使目的基因 DNA受熱變性后解鏈為單鏈

。PCR過程中需要使用

Taq（或耐高溫的DNA聚合聚合）

Taq（或耐高溫的DNA聚合聚合）

酶。
（2）回收PCR產(chǎn)物并酶切后用

DNA連接酶

DNA連接酶

將At-CBF1 基因連接到T質(zhì)粒上，以得到T-CBF1重組質(zhì)粒。構(gòu)建T-CBF1重組質(zhì)粒時，同時使用BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切的目的是

產(chǎn)生不同的黏性末端，使目的基因和質(zhì)粒定向連接

產(chǎn)生不同的黏性末端，使目的基因和質(zhì)粒定向連接

。
（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，培育后篩選轉(zhuǎn)化陽性的植株。若采用分子雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，則需要將

放射性標(biāo)記的 At-CBF1基因

放射性標(biāo)記的 At-CBF1基因

片段制成探針。
（4）為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的抗寒機(jī)制，還需要進(jìn)一步開展研究。請完成如圖研究技術(shù)路線圖。