RT-PCR技術(shù)是將病毒的反轉(zhuǎn)錄（RT）與PCR相結(jié)合，在生物體外進(jìn)行的核酸合成技術(shù)，其流程如圖所示。我國(guó)科研人員利用RT-PCR技術(shù)獲得了新冠病毒的關(guān)鍵基因，導(dǎo)入到工程細(xì)胞成功表達(dá)出S蛋白，這正是我國(guó)新冠病毒疫苗的研發(fā)路徑之一。請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題：

（1）圖中核酸酶H的作用是

使RNA單鏈與逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA單鏈分離

使RNA單鏈與逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA單鏈分離

。
（2）PCR反應(yīng)的基本步驟是③

變性

變性

、④

復(fù)性

復(fù)性

、⑤延伸，這主要借助對(duì)

溫度

溫度

的控制，使得反應(yīng)有序進(jìn)行。其中④溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵，該溫度的設(shè)定與引物的長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但堿基對(duì)

G-C

G-C

含量高的引物需要設(shè)定更高的溫度。
（3）進(jìn)行RT-PCR過(guò)程中，引物a和b的堿基序列

不相同不互補(bǔ)

不相同不互補(bǔ)

（填“相同”“互補(bǔ)”或“不相同不互補(bǔ)”），若欲對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上至少需要引物a和b共

2×2^n-1

2×2^n-1

個(gè)。
（4）RT-PCR的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，可與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切得到的PBV載體連接，該操作稱為

基因表達(dá)載體的構(gòu)建

基因表達(dá)載體的構(gòu)建

，也是基因工程的核心步驟。與單一酶切相比，雙酶切具有的優(yōu)點(diǎn)是

防止目的基因（載體）自身連接，防止目的基因與運(yùn)載體反向連接

防止目的基因（載體）自身連接，防止目的基因與運(yùn)載體反向連接

。