氨基酸定點突變分析是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能、酶催化機理以及對基因表達產(chǎn)物進行定向改造的重要技術(shù)。在基因內(nèi)部引入點突變，是獲得氨基酸定點突變的主要方式。如圖1是利用PCR介導(dǎo)的定點突變技術(shù)的原理圖，其中三個引物分別為F1（5'-GGAATTCCATATGAGGATCCTCTTTC-3'）（GAATTC為EcoRⅠ識別位點，并切割G和A之間的磷酸二酯鍵，CATATG為NdeⅠ的識別序列，并切割C和A之間的磷酸二酯鍵）、F2（5'-TGGGACGACTTCGCCTCGACCATGC-3'）（黑體GA為突變堿基）和R2（5'-CCCCCCGGGGGCGGCCAGCCGCTC-3'）（CCCGGG為SmaⅠ的識別序列，并切割C和G之間的磷酸二酯鍵），野生型基因已連接在質(zhì)粒PIK340上，且序列已知。

（1）第2輪PCR是在第1輪PCR的反應(yīng)體系中進行的，雖然只加入了F1引物，但仍能得到突變基因的原因是

引物1和含有突變位點的片段可以作為一對引物對野生型基因進行PCR

引物1和含有突變位點的片段可以作為一對引物對野生型基因進行PCR

，得到的突變基因與pT7Blue質(zhì)粒連接時需用的酶是

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

。（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）
（2）在IPTG和X-gal存在的條件下，Laz基因表達后，產(chǎn)生藍色物質(zhì)，否則為白色。據(jù)圖分析，在固體培養(yǎng)基上添加IPTG和X-gal后，形成的白色菌落不一定是成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌，理由是

大腸桿菌細胞內(nèi)沒有Laz基因

大腸桿菌細胞內(nèi)沒有Laz基因

。若要選出成功導(dǎo)入克隆載體的大腸桿菌，還應(yīng)在培養(yǎng)基中加入

氨芐青霉素

氨芐青霉素

。
（3）為驗證白色菌落中是否成功導(dǎo)入克隆載體，用EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2：
①據(jù)圖分析，該突變基因的長度大約為

1.13kb

1.13kb

。
②為驗證2～8號樣品中是否發(fā)生了預(yù)期突變，隨機抽取四組進行測序，并與野生型基因進行對比，結(jié)果如圖3，該結(jié)果說明

2～8號樣品中發(fā)生了預(yù)期突變

2～8號樣品中發(fā)生了預(yù)期突變

。
（4）若該突變基因成功表達，則可獲得氨基酸定點突變的蛋白質(zhì)，該工程與基因工程的區(qū)別是

可以生產(chǎn)自然界中不存在的蛋白質(zhì)

可以生產(chǎn)自然界中不存在的蛋白質(zhì)

。